Базируясь на концепции эволюционного развития живой природы, можно с высокой долей уверенности утверждать, что в процессе исторического развития человек находился и по сегодняшний день находится в теснейшем контакте с миром микроорганизмов.

Этот контакт нередко приводил к конфликтам в виде микробных заболеваний человека, причем такие конфликты иногда перерастали в массовые заболевания людей – эпидемии и пандемии. Болезнетворность ряда микроорганизмов (в первую очередь бактерий) даже обусловила генетическую детерминированность вкусовых и обонятельных рецепторов человека на неприятие пищи или воды (попробуйте понюхать протухшее мясо), содержащих продукты бактериальной жизнедеятельности.

Широко известны и модели социального поведения человека, оберегающие его от заболеваний бактериальной природы (умывание рук перед приемом пищи, прием горячих напитков, использование специй с бактерицидным действием, отказ от приема мяса определенных видов животных, мода на посуду из золота и серебра).

С другой стороны, столь же долго известны и полезные свойства микроорганизмов.

С помощью микроорганизмов человек с незапамятных времен научился изготавливать различные молочные продукты (сыры, творог, кефир, йогурт, брынзу), консервировать колбасы и мясо. Но более важным является способность микроорганизмов колонизировать организм человека. Микроорганизмы обнаруживаются на коже, слизистых, в легких, желудке, а также в просвете кишечника. По некоторым оценкам только в толстом кишечнике обнаруживается до 5 килограммов бактериальных клеток принадлежащих к 400 различным видам.

Мы поставляем кишечным бактериям энергию в виде продуктов питания и продуктов распада клеток, а они помогают нам гидролизовать белки, жиры и углеводы, синтезируют витамины и гормоны, стимулируют иммунную систему и защищают нас от болезнетворных микробов [1]. Бактерии, например, переваривают за нас всю клетчатку и до 70% жиров, обеспечивают обмен холестерина и билирубина [2].

Важность нормальной микрофлоры наиболее отчетливо видна в экспериментах с безмикробными, то есть выросшими в отсутствии микроорганизмов животными. У безмикробных животных фактически все органы и системы отстают в развитии, а устойчивость к инфекции резко снижена [2].

Полезные свойства некоторых микроорганизмов человека обусловили появление нового направления в терапии — лечения бактериальными препаратами- пробиотиками.

Задачей пробиотика является восстановление нарушенного микробиоценоза человека и, соответственно, тех защитных и синтетических свойств, присущих данному виду бактерий, о которых говорилось выше. Учитывая неоднозначность роли микроорганизмов в жизни человека, необычайно важным является детальное изучение свойств того или иного микроорганизма.

Однако, выбор бактериального вида и штамма в качестве пробиотического наиболее часто обусловлен не знанием о природе микроорганизма или принципами доказательной медицины, а в соответствии с мало доказанными воззрениями клиницистов прошлого.

Например, ранее считалось, что основным критерием кишечного микробиоценоза является содержание в толстом кишечнике бифидобактерий, и поэтому лечить следует пробиотиками с бифидобактериями. Однако, клинический опыт применения препаратов-пробиотиков на основе исключительно бифидобактерий показывает, что данные препараты дают лишь временный позитивный эффект даже по уровню содержания бифидобактерий.

Опыт научного подхода использования штаммов бактерий, используемых для коррекции дисбиозов, позволил разработать ряд критериев, являющихся важными для оценки используемого пробиотика.

Первым свойством, указанным в данном перечне свойств, является безвредность.

Критерии GRAS (Generally regarded as safe – «Обычно рассматриваются как безопасные»), предполагают длительное использование больших дозировок бактериального штамма, как минимум в 100 раз превышающих терапевтическую дозировку, без каких-либо патологических последствий для человека или испытуемого лабораторного животного.

Однако, реальные механизмы, которые потенциально могут приводить к возникновению заболеваний вследствие приема такого пробиотического штамма вообще не изучаются и не исследуются. Существует лишь практика осторожного отношения к тем бактериям, генетически родственные штаммы которых могут вызывать инфекционные процессы.

Антагонизм к патогенным бактериям обычно определяют на стандартном наборе патогенных бактерий, наблюдая степень подавления роста возбудителей заболеваний на агаре.

Важным критерием является технологичность штамма и его устойчивость к воздействиям различных физико-химических факторов.

Многие бактериальные штаммы, обладающие прекрасными биологическими характеристиками не выдерживают минимальной температурной обработки и, что особенно важно, не выдерживают воздействия желчи и кислот, а, значит, при приеме внутрь бактерии погибают не достигнув кишечника.

Существенным является также применение штаммов, относящихся к природным обитателям кишечника. Широко известен опыт использования в качестве пробиотиков дрожжей или сенной палочки. Обладая хорошим антагонизмом или витаминообразованием, транзиторные штаммы могут оказывать положительное клиническое воздействие на организм больного.

Однако, в данном случае трудно рассчитывать на длительное положительное действие. Следует также иметь в виду, что микроорганизмы, не являющиеся нормальными обитателями кишечника по определению воспринимаются как чужеродный комплекс антигенов. Соответственно и нагрузка на систему иммунитета хозяина может быть необоснованно большой.

Исходя из соображений, отмеченных выше, штамм-пробиотик перед введением в практику требует углубленного научного исследования.

В основу данной работы было положено изучение микробиологических характеристик штамма Enterococcus faecium L-3. Выбор этого штамма, депонированного в хранилище микробных штаммов под номером «ND-79 ВНИИСХМ» связан с тем, что данный штамм, выделенный из сметаны, в предварительных экспериментах обладал наиболее выраженным антагонизмом по отношению к патогенным бактериям и дрожжам.

Выбор штамма энтерококков в качестве пробиотика является ответственным решением ввиду того, что для клиницистов с родом энтерококков связаны достаточно тяжелые заболевания и даже госпитальные инфекции.

Однако, эти заболевания обычно вызваны штаммами Enterococcus faecalis устойчивых к ванкомицину, от которых молочнокислые энтерококки далеки как генетически, так и физиологически.

Штаммы Enterococcus faecium веками используются для изготовления мягких острых сыров (например, брынза) или колбас длительного хранения. Недавние исследования показали, что вирулентные штаммы энтерококков отличаются от полезных штаммов наличием огромных с точки зрения генетика вставок «островов вирулентности». Данные вставки, достигающие 100 тысяч нуклеотидных пар, содержат протяженные кластеры генов, необходимых для реализации вирулентных свойств.

Поэтому, опасения неожиданного превращения молочнокислого штамма энтерококков в патогенный мало обоснованы. Более того, ряд молочнокислых энтерококков даже используется для лечения заболеваний, вызванных патогенными энтерококками.

Проверка штамма L-3 на предмет безопасности его клинического применения была проведена на большой группе лабораторных животных (крысы и мыши), когда животные получали биодозу данного штамма в 100 раз превосходящую клиническую в течение месяца. При этом состояние животных не только не ухудшилось, но они статистически достоверно прибавляли в весе, по сравнению с контрольной группой. У животных основной группы не менялся стул, не менялся цвет и характер шерстяного покрова и т.п. Вскрытие лабораторных животных после окончания эксперимента также не выявило никаких патологических изменений в системах и органах.

Генетическая характеристика штамма L-3 показала, что данный штамм содержит гены двух бактериоцинов энтероцина А и энтероцина В, относящихся к бактериоцинам второго класса [5]. Наличие гена подтверждалась полимеразной цепной реакцией с ДНК праймерами на гены энтероцинов A и В.

В результате реакции амплификации с каждой из пар праймеров (30 циклов при температуре синтеза 520С) образовывался фрагмент ДНК размером 200 нуклеотидных пар, что полностью соответствует ожидаемым размерам данного генов у энтерококков (рис. 1).

Наличием двух генов бактериоцинов (энтероцина А и энтероцина В) в геноме штамма L-3, вероятно, обусловлена антагонистическая активность данного штамма по отношению к патогенным бактериям, обнаруженная ранее. В клинических исследованиях штамм L-3 подавлял рост как грамположительных, так и грамотрицательных патогенных микроорганизмов (рис.2).

Оценка характера витаминообразования шамма L-3 проводилась в сравнении с двумя другими бактериальными молочнокислыми заквасками, рекламируемыми как витаминообразующие. Результаты характера витаминобразования представлены в таблице 1.

Как видно из результатов исследования, молочнокислая закваска на основе штамма L-3 по содержанию витаминов В1, В2 и РР превосходит известные витаминообразующие молочнокислые закваски. Так закваска L-3 более, чем в 2 раза превосходит закваску ВНИИЖ по уровню продукции витамина В2 и почти в 4 раза превосходит закваску Эвита по продукции витамина РР.

Следующим важным критерием является жизнестойкость бактериального штамма-пробиотика. Проверка по этим параметрам энтерококков L-3 выявила поистине уникальные свойства данного штамма. Оказалось, что бактерии штамма L-3 растут в широком диапазоне питательных сред – от синтетических до простого молока и устойчивы к высоким температурам. Характер роста бактерий при температуре 45°С не отличается от роста при 37°С. Бактерии сохраняют жизнеспособность и при 55°С.

Штамм L-3 оказался способен расти в высокой концентрации солей (6.5М NaCl), устойчив к кислотам, и, что особенно, важно к желчи.

Как видно из данных таблицы 2, штамм L-3 развивается в присутствии желчи даже лучше, чем без нее, в отличие от кишечной палочки, рост которой ингибируется даже незначительной концентрацией желчи.

Для выяснения степени сродства исследуемого штамма энтерококков к человеческому эпителию нами были произведены сравнительные исследования способности прилипания бактерий к эпителию. В качестве пробиотиков сравнения были использованы широко изученные и распространяемые во всем мире бактериальные штаммы пробиотиов: Bifidobacterium longum (Shaklee), Lactobacillus GG, Lactobacillus reuteri (BioGala).

Дополнительным контролем было введение штамма патогенных стрептококков группы В (В219), обладающего сродством к вагинальному и кишечному эпителию. Результаты исследования адгезии приведены в таблице 3 ( исследование проводилось при концентрации клеток в растворе OD540-0,025).

Из данных таблицы отчетливо видно, что по характеру адгезии к эпителию энтерококки не уступают широко известным пробиотикам, что указывает на существование у данного штамма специализированных механизмов прилипания.

Обращает на себя внимание и тот факт, что патогенные бактерии также обладают существенной адгезивностью, что указывает на роль пробиотиков в обеспечения конкуренции с патогенами за сайты «посадки» на поверхности эпителия.
Этот факт особенно важен в свете частого и иногда необоснованного применения антибиотиков во врачебной практике. Полезные бактерии, погибшие в результате антибиотикотерапии, могут быть практически моментально заменены патогенами. В такой ситуации даже терапия пробиотиками после лечения инфекции не даст результата.

Поэтому терапию пробиотиками следует начинать незамедлительно, а лучше совместно с антибиотикотерапией.

Положительной стороной штамма является его широкий спектр антибиотикоустойчивости. Устойчивость к гентамицину, рифампицину, оксациллину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефалексину, метициллину, тобрамицину позволяет совмещать терапию этими антибиотиками с приемом данного штамма.

Подводя итог проведенному исследованию штамма L-3 можно сделать вывод о том, что данный штамм обладает всеми необходимыми свойствами для современного и эффективного пробиотика.

Безопасность, высокая антагонистическая активность в отношении патогенной флоры, хорошая адгезивность, способность к витаминообразованию и удивительная жизнестойкость делает данный штамм кандидатом для создания целого семейства пробиотических продуктов. Один из таких продуктов – драже Ламинолакт уже завоевал доверие клиницистов.