Хронические гастриты, среди которых НР-ассоциированные имеют наибольший удельный вес, являются одной из актуальных проблем гастроэнтерологии (Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. 1999; Ткаченко Е.И. 1999). Это объясняется как частотой данного страдания, так и тем, что некоторые варианты гастритов рассматриваются в качестве предраковых заболеваний. После открытия Helicobacter pylori B. Marshall и J. Warren в 1983г. началась «эра хеликобактера». В настоящее время не оспаривается его ведущая роль в генезе хронического НР-ассоциированного гастрита.

Однако существует диссоциация между частотой инфицированности данным микроорганизмом и количеством больных хроническим гастритом. Это обусловило изучение факторов патогенности Н.pylori и выявление CagA, VacA, уреазы, определяющих вирулентность штаммов микроорганизма (van Doorn L.J., Figueiredo C., Sanna R. 1998; Домарадский И.В., Исаков В.А. 2000). Кроме того, как и при любом заболевании, связанном с инфекционным агентом, макроорганизм может быть более или менее восприимчивым к нему.

В ходе исследований были выявлены иммуногенетические характеристики, определяющие предрасположенность к развитию НР-ассоциированных гастритов (носительство определенных аллелей антигенов HLA II класса) (Chiba M., Ishii N. 1995; Caselli M., Balboni A. 1997; Бондаренко А.Л. 1999).

В слизистой оболочке желудка при НР-инфекции развивается хронический воспалительный процесс. В этом аспекте важное значение может иметь изучение роли кишечной эндоэкосистемы, как одного из ведущих звеньев, обеспечивающих иммунную реактивность организма. Кроме того, имеются данные о влиянии состояния кишечного биоценоза на реализацию местного иммунного ответа слизистой оболочки желудка (Шендеров Б.А. 1998; Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. 2000).

Желудочно-кишечный тракт представляет собой единую систему, в которой все звенья взаимосвязаны. В этой связи важным является изучение взаимного влияния патологии желудка и кишечника, а также действие эрадикационной антигеликобактерной терапии на состояние кишечного микробиоценоза и коррекции дисбиотических изменений на течение НР-ассоциированного гастрита.

Установлено, что эрадикация Н.pylori является обязательным условием предупреждения рецидива заболевания, восстановления нормальной структуры слизистой желудка.

Однако даже в условиях использования мощной антибактериальной терапии, процент успешной эрадикации Н.pylori снижается (Исаков В.А., Доморадский И.В. 2003). Актуальным становится поиск новых подходов к повышению эффективности эрадикационной терапии, качества иммунного ответа организма.

Особый интерес представляет возможность использования синбиотических препаратов, не только не нарушающих равновесие в кишечном биоценозе, но напротив, способствующих его восстановлению при дисбиозе, а, следовательно, и улучшающих качество иммунного ответа макроорганизма и местной иммунной реактивности слизистой оболочки желудка.

Кроме того, важным представляется исследование возможности влияния на частоту достижения эрадикации иммуногенетических особенностей макроорганизма и генотипических особенностей микроорганизма. Указанные проблемы делают актуальным дальнейшее изучение как факторов патогенности H.pylori, так и особенностей макроорганизма пациентов с НР-ассоциированным гастритом с целью создания теоретической базы для разработки новых терапевтических подходов по отношению к H.pylori-ассоциированным страданиям.

Исследование состояния кишечного микробиоценоза при НР-ассоциированных гастритах и влияния коррекции дисбиотических нарушений на течение заболевания. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

В исследовании был впервые разработан способ воздействия на хроническое воспаление в слизистой оболочке желудка при НР-ассоциированном гастрите путем нормализации кишечного микробиоценоза и использовании с этой целью монотерапии препаратом «Ламинолакт».

Выявлено позитивное влияние нормализации кишечного микробиоценоза на частоту достижения эрадикации H.pylori у пациентов с НР-ассоциированным гастритом. Определены иммуногенетические характеристики пациентов и генотипические особенности H.pylori, влияющие на частоту достижения эрадикации микроорганизма.

Проанализировано состояние местного гуморального иммунитета (уровень секреторного IgA) у пациентов с НР-ассоциированным гастритом и влияние эрадикации H.pylori на уровень sIgA. По результатам исследования оформлена заявка на изобретение №2002129641/20(031184) и получено положительное решение от 19 августа 2004 г.

Показана возможность повышения эффективности стандартной триплексной эрадикационной терапии путем комбинации ее с синбиотическим препаратом, а также возможность монотерапии НР-ассоциированного гастрита с использованием синбиотика «Ламинолакт», особенно в случаях, когда применение антибактериальных препаратов невозможно или нежелательно. Обосновано проведение HLA-DRB1– типирования пациентов с НР-ассоциированным гастритом и cagA-типирования H.pylori с целью определения объема дальнейшего терапевтического воздействия.

Вклад автора в исследование заключался в определении основной цели работы, личном участии в клиническом, молекулярно-генетическом исследовании пациентов, а также лечебных мероприятиях, выполнении статистической обработки и анализа полученных данных.

Полученные результаты внедрены в педагогический и научно-исследовательский процесс на кафедре терапии и клинической фармакологии СПб МАПО, а также научно-исследовательскую работу НИИ Экспериментальной медицины и лечебно-диагностический процесс гастроэнтерологического отделения больницы №26.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Результаты исследования доложены:

Диссертация изложена на 117 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 8 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 38 отечественных и 162 иностранных источника литературы, иллюстрирована 21 таблицей и 15 рисунками.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
На основе клинико-лабораторного исследования 86 пациентов было выделено 75 человек, страдающих H.pylori-ассоциированным гастритом. Методом случайной выборки пациенты были разделены на 3 группы по 25 человек. Средний возраст в 1 группе составил 35,4±2,38 года, соотношение мужчин и женщин – 12 (48%) и 13 (52%) человек соответственно, средняя продолжительность заболевания - 3,8±0,37 года. Во 2 группе количество мужчин составило 16 (64%) человек, женщин – 9 (36%), средний возраст - 38,8±2,8 лет и средняя продолжительность заболевания - 4,12±0,57 года. В третьей группе было 11 (44%) мужчин и 14 (56%) женщин, средний возраст составил 36,6±3,08 лет и средняя продолжительность заболевания - 4,2±0,59 года. Достоверных различий между группами по полу, возрасту и средней длительности заболевания не выявлено.

В соответствии с поставленными задачами пациенты в группах получали различные схемы терапии. Пациентам 1 группы проводилась стандартная семидневная эрадикационная терапия, включавшая амоксициллин в дозе 2 г/сут., кларитромицин – 1 г/сут. и рабепразол в дозе 40 мг/сут. Во второй группе пациенты получали комбинированную терапию, состоявшую из вышеописанной стандартной семидневной эрадикационной схемы и синбиотического препарата «Ламинолакт», который назначался спустя 1 неделю после окончания эрадикационной терапии в дозе 3 драже 3 раза в день в течение 1 месяца. В 3 группе пациенты получали монотерапию «Ламинолактом» в такой же дозировке. Обследование на этапе наблюдения проводилось трижды: до лечения, через 2 месяца после окончания терапии и через 6 месяцев.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Всем больным проводилось комплексное клиническое обследование. Из клинических симптомов отмечалось наличие боли, болезненности при пальпации в эпигастральной области, диспепсических проявлений; оценка показателей проводилась полуколичественным методом в зависимости от степени их выраженности. Методы инструментальной диагностики включали фиброгастродуоденоскопию с забором биоптатов из луковицы 12-перстной кишки (1 биоптат), тела желудка (1 биоптат) и антрального отдела (3 биоптата). Кроме этого оценивалась распространенность воспалительных изменений в слизистой оболочке желудка (гастродуоденит, антральный гастрит, пангастрит), а также степень выраженности отека, гиперемии с использованием полуколичественного метода оценки.

При гистологическом исследовании биоптатов из антрального отдела и нижней трети тела желудка применялась окраска гематоксилин-эозином и оценивалась степень инфильтрации слизистой оболочки нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами. Для определения уровня sIgA использовались биоптаты из антрального отдела желудка. Оценка проводилась двумя методами: с применением антисыворотки к sIgA и антител к рецепторам sIgA. Результаты, полученные при использовании обеих методик, были идентичными.

Основным методом диагностики H.pylori-инфекции была полимеразная цепная реакция с применением праймеров к генам ure B, cag A и cag H. Для ПЦР-исследования использовались биоптаты антрального отдела желудка. В качестве дополнительных диагностических методов применялись быстрый уреазный тест и иммуноферментный анализ для обнаружения IgG антител к антигенам Helicobacter pylori и к белку CagA, который проводился на базе Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера г. Санкт-Петербург.

Исследование состояния кишечной микрофлоры проводилось на базе бактериологической лаборатории Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины. Для определения степени выявленных дисбиотических изменений пользовались классификацией Кузнецовой Г.Г., 1972 г. Все перечисленные методы исследования проводились на этапе наблюдения трижды: до лечения, спустя 2 месяца после проведенной терапии и через 6 месяцев. Молекулярное типирование HLA-генов II класса проводилось на базе Санкт-Петербургского научно-исследовательского института переливания крови; исследовался локус HLA-DRB1*.

Статистическую обработку результатов проводили при помощи пакета STATISTICA 5.5. В случаях нормального распределения величин использовали параметрические методы исследования (t-критерий Стьюдента, корреляционный анализ). В других случаях применялись непараметрические методы исследования – U критерий Манна-Уитни, двухвыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, T-критерий Вилкоксона, ранговый коэффициент Спирмена. Достоверными считались различия, при которых коэффициент доверительной вероятности (p) был ниже 0,05. Для установления связей между показателями проводили корреляционный анализ.

При оценке клинических показателей после проведенной терапии отмечалось их достоверное улучшение у пациентов всех трех групп независимо от эрадикации H.pylori.

При анализе результатов уреазного теста у пациентов до лечения примерно у 50% отмечалась выраженная степень уреазной активности. После проведения терапии в случае эрадикации H.pylori уреазный тест был отрицательным. В оставшихся случаях лишь у четверти пациентов отмечалась выраженная степень уреазной активности, преобладали умеренная и слабая. При сравнении показателей уреазной активности у пациентов с cagA-позитивными и cagA-негативными штаммами геликобактера зависимости между выраженностью активности и генотипом H.pylori не выявлено.

В результате гистологического исследования гастробиоптатов в 80% случаев определялась умеренная и выраженная степень лейкоцитарной инфильтрации слизистой оболочки желудка, что отражало степень активности воспалительного процесса. При анализе выраженности лейкоцитарной инфильтрации у пациентов с различными генотипами H.pylori зависимости между степенью инфильтрации и наличием cagA-гена не выявлено, более того, у пациентов с cagA-позитивными штаммами H.pylori достоверно чаще определялась слабая степень лейкоцитарной инфильтрации.

Зависимости между степенью лимфоцитарной инфильтрации и cagA-статусом H.pylori также не выявлено.

При контрольном исследовании степень лейкоцитарной инфильтрации достоверно снижалась в случае эрадикации H.pylori (р<0,05); лимфоцитарная инфильтрация уменьшалась достоверно лишь в случае эрадикации H.pylori и наличия синбиотического препарата в схеме терапии, поскольку у пациентов, получавших только эрадикационную терапию даже в случае отсутствия H.pylori при контрольном исследовании степень лимфоцитарной инфильтрации изменялась недостоверно (р>0,05).

При серологическом исследовании у всех пациентов в крови обнаруживались антитела к поверхностным антигенам H.pylori, а у пациентов, имевших cagA-позитивные штаммы геликобактера - и к CagA-токсину. После проведения терапии уровень антител достоверно снижался в случае эрадикации H.pylori (p<0,05), в остальных случаях изменение титра антител было недостоверным.

В качестве показателя иммунной реактивности слизистой оболочки желудка оценивался уровень секреторного IgA. Была проанализирована возможность зависимости уровня sIgA от различных показателей. В результате статистической обработки выявлена обратная корреляционная связь между длительностью заболевания и возрастом пациентов (р<0,05): изначально уровень IgA был ниже у пациентов более пожилого возраста и с более длительным анамнезом гастрита. Вероятно, это объясняется развитием процесса атрофии в слизистой оболочке, имеющим место в том и в другом случае. Кроме того, после проведенной терапии в случае эффективной эрадикации H.pylori уровень sIgA также достоверно снижался, что, по всей видимости, связано с прекращением антигенной стимуляции.

Одной из задач данного исследовании была оценка состояния кишечного микробиоценоза у пациентов с НР-ассоциированным гастритом, а также состава кишечной микрофлоры после применения различных схем терапии. По данным обследования первоначально у 80% пациентов (60 человек) с НР-ассоциированным гастритом определялись дисбиотические нарушения (1-3 степень дисбиоза). После проведенного лечения у пациентов, получавших комбинированную терапию, включавшую стандартную эрадикационную тройную схему в сочетании с синбиотическим препаратом, или монотерапию синбиотиком «Ламинолакт», достоверно улучшилось состояние кишечного микробиоценоза, повысился уровень бифидобактерий, энтерококков. У пациентов, получавших только стандартную эрадикационную терапию, состояние кишечной микробиоценоза значимо не изменилось, кроме того, у ряда больных отмечалось снижение содержания представителей нормальной кишечной микрофлоры (лактозопозитивной E.coli).

Полученные данные свидетельствуют о том, что на фоне стандартной эрадикационной терапии состояние кишечного микробиоценоза у пациентов существенно не улучшается, а в ряде случаев имеет место его ухудшение. В случае комбинации эрадикационной терапии с синбиотическим препаратом достоверно снижается степень дисбиотических нарушений, а также улучшается микробный пейзаж.

Особый интерес представляла возможность воздействия на хроническое воспаление в слизистой оболочке желудка путем повышения иммунной реактивности макроорганизма на фоне применения синбиотического препарата и нормализации кишечного микробиоценоза, а также использование прямого антагонистического действия на H.pylori представителей нормальной кишечной микрофлоры. В ряде экспериментальных исследований было показано, что культура или препараты, изготовленные из культур лактобацилл и ряда других микроорганизмов, населяющих желудочно-кишечный тракт человека, могут подавлять жизнедеятельность H.pylori. Так, в частности, было выявлено, что пробиотики могут предупреждать адгезию H.pylori к мембранам клеток и его размножение. Кроме того, есть данные о том, что добавление пробиотиков к стандартным схемам антихеликобактерной терапии незначительно улучшало частоту эрадикации H.pylori, но помимо этого существенно снижало частоту побочных действий применяемых препаратов и повышало приверженность пациентов к лечению. Таким образом, применение пробиотиков с целью эрадикации H.pylori является перспективным направлением в терапии НР-ассоциированных заболеваний.

В данном исследовании с этой целью применялась монотерапия синбиотическим препаратом «Ламинолакт» и комбинация его со стандартной эрадикационной триплексной схемой. На фоне монотерапии синбиотиком эффективность эрадикации H.pylori составила 48%. Полученный результат является достоверным и обусловлен именно действием синбиотика, так как уровень спонтанной эрадикации H.pylori по литературным данным составляет 3%. Эффект «Ламинолакта» в отношении H.pylori может быть обусловлен как прямым, так и опосредованным действием входящих в его состав Enterococcus faecium L-3. Основой прямой антагонистической активности штамма L-3 является факт продукции ряда бактериоцинов. В частности, в геноме штамма содержатся гены двух бактериоцинов: энтероцина А и энтероцина В. E.faecium L-3 обладают устойчивостью к действию соляной кислоты, таким образом, они, вероятно, могут вступать во взаимодействие с H.pylori, находясь в желудке. В кишечнике синбиотик способствует нормализации микробной экологии, ингибируя рост потенциально вредных микроорганизмов. Это осуществляется в результате продукции антимикробных субстанций, конкуренции за рецепторы адгезии и питательные вещества, активации иммунно-компетентных клеток и стимуляции иммунитета. Таким образом, нормализуя иммунную реактивность слизистой оболочки кишки, он, вероятно, опосредованно может воздействовать на иммунную реактивность слизистой оболочки желудка, тем самым влияя на H.pylori-индуцированное хроническое воспаление. Подтверждением этого эффекта может быть выявленное в результате данного исследования достоверное снижение степени лимфоцитарной инфильтрации слизистой оболочки желудка у пациентов с эффективной эрадикацией H.pylori и наличием синбиотика в схеме терапии. Полученные данные свидетельствуют о том, что монотерапию синбиотиком «Ламинолакт» можно использовать при лечении НР-ассоциированного гастрита. Он может стать препаратом выбора в случаях, когда применение антибактериальных средств невозможно или нежелательно.

В случае с комбинированной терапией эффективность эрадикации составила 84% (для сравнения – в группе со стандартной терапией – 68%). И хотя разница между результатами в группе со стандартной и комбинированной терапией достоверно не значима, применение «Ламинолакта» улучшило частоту эрадикации. На фоне применения синбиотика достоверно улучшилось состояние кишечного микробиоценоза.

Во взаимоотношениях микро- и макроорганизма особый интерес представляет генотип H.pylori и возможность его влияния на эффективность эрадикации. С этой целью нами исследовался cag-статус пациентов. Cag-регулон в островке патогенности H.pylori неоднороден и включает в себя различные cag-гены. В настоящее время известно множество генов cag-островка, но наиболее изученным является cagA. Многочисленными исследованиями доказано, что наличие cagA в геноме H.pylori повышает риск развития дуоденальной язвы, MALTомы желудка. Однако данные об исследованиях зависимости эффективности эрадикационной терапии от cagА-статуса H.pylori у пациентов с НР-ассоциированным гастритом в доступной литературе обнаружить не удалось. Поскольку cagA склонен к частым мутациям, что может затруднять диагностику, нами была рассмотрена возможность использовать в качестве маркера патогенности штамма H.pylori другой ген из cag-регулона. С этой целью, помимо определения cagA, проводилось типирование cagH-гена, поскольку он обладает меньшей молекулярной массой и более стабильной структурой. Достоверных корреляций между cagH-статусом и эффективностью эрадикационной терапии выявлено не было. В то время как между cagA-статусом пациентов и эффективностью эрадикации была выявлена обратная зависимость (р<0,05): при одинаковых схемах лечения эрадикация у пациентов с cagA-позитивными штаммами H.pylori была достоверно менее эффективной, чем у пациентов, имевших cagА-негативные штаммы. Данная зависимость выявлялась у пациентов 1 и 2 группы, у пациентов, получавших монотерапию «Ламинолактом» такая взаимосвязь отсутствовала. Вероятно, cagA способен изменять иммунную реактивность слизистой оболочки желудка, снижая защитные силы. В данном случае необходимо в первую очередь воздействовать на иммунную защиту макроорганизма. При сравнении групп со стандартной эрадикационной терапией и комбинированной можно отметить, что добавление синбиотика к терапии улучшило эффективность эрадикации. Таким образом, исследование генотипа H.pylori и, в частности, cagA-статуса является важным диагностическим критерием в выборе тактики терапии.

Представленные данные, характеризующие особенности H.pylori у больных с хроническим гастритом, а также зависимость исхода терапии от генотипа бактерии, делают необходимым обсуждение путей реализации факторов патогенности микроорганизма и возможного влияния иммуногенетических особенностей пациентов на исход терапии. В связи с этим нами было предпринято исследование HLA антигенов II класса. Работ, посвященных этой проблеме, в литературе немного. Японскими авторами описываются данные, отражающие связь между наличием хронического НР-ассоциированного гастрита и такими антигенами, как HLA-DRB1*1302 и HLA-DRB1*0901. На кафедре терапии и клинической фармакологии ГОУ ДПО СПбМАПО было начато исследование иммуногенетических особенностей пациентов с НР-ассоциированным гастритом, и в работе Фадль Б. отражена связь этой патологии с такими генами, как HLA-DRB1*16.

В данной работе также рассматривался вопрос взаимодействия микро- и макроорганизма. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании у обследованных пациентов с хроническим НР-ассоциированным гастритом по сравнению со здоровыми жителями Северо-Запада генотипа HLA-DRB1*16. Эти данные соответствуют полученным ранее. Кроме того, у пациентов с cagA-позитивными штаммами H.pylori достоверно реже встречалась HLA-DRB1*11 аллель. Также были проанализированы группы пациентов, у которых удалось добиться эрадикации H.pylori и пациенты, у которых эрадикация оказалась неэффективной. В группе с отсутствием H.pylori после проведенной терапии, достоверно реже встречалась аллель HLA-DRB1*11, там же, где эрадикации добиться не удалось, чаще, чем в группе здоровых жителей и группе с достигнутой эрадикацией, определялась аллель HLA-DRB1*09.
Изучение гетерогенности микро- и макроорганизма, проведенное в данном исследовании, позволяет считать, что хронический H.pylori-ассоциированный гастрит развивается у иммуногенетически предрасположенных лиц в условиях контакта с патогенными штаммами микроорганизма. Кроме того, исход терапии помимо генотипа H.pylori определяется иммуногенетическими особенностями пациента.